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间充质干细胞治疗嵴髓损伤临床分析_徐彪杰

【摘要】 目的 观察间充质干细胞治疗嵴髓损伤(sci)的临床效果及安全性。方法

对2008年1月至2010年10月收治的22例sci患者,给予uc-mscs鞘内注射治疗,细胞数1x106个/kg.次,1

次/周,4次为1个疗程,其中4例接受两疗程,1例接受3疗程,余均接受1

个疗程。采用美国嵴髓损伤协会制定的嵴髓损伤神经功能评分标准(asia标准)对患者治疗前后神经功能进行评定,采用国际神经修复学会嵴髓损伤功能评价量表(ianr-scirfs)对患者治疗前后日常生活活动能力进行评定。结果

22例患者中13例有效,9例无效。不完全性sci患者有效率达81.25%,完全性sci的6例患者均无效。有5例有效的患者接受了2~3个疗程治疗,疗效均有进一步的提高。有效患者多表现为运动和/或感觉功能改善,大小便控制能力增强。22例患者治疗后1个月与治疗前两组间比较痛觉、触觉、运动、日常生活活动能力评分有明显升高(p

资料与间充质干细胞治疗方法

一、 研究对象

间充质干细胞治疗对象选择自我科2008年1月至2010年10月收治的22例sci患者,男17例,女5例,年龄19~51岁,平均年龄33岁;损伤部位:颈髓4例,颈髓+胸髓2例,胸髓7例,胸髓+腰髓2例,腰髓7例;损伤时间2~204月,平均56个月。损伤原因:车祸8例,高空坠落7例,砸伤及跳水损伤各2例,摔伤、嵴髓炎后遗症、嵴髓栓系综合征各1例。对患者的治疗及风险如实告知,患者对治疗均签署知情同意书,间充质干细胞治疗方桉经医院医学伦理委员会批准。所有患者均具有干细胞治疗适应症:无发热、感染,无凝血功能及心、肺、肝、肾等重要脏器功能障碍。术前对患者进行总体评估:体格检查,ecg、嵴髓损伤部位mri检查,血、尿、便常规、肝肾功、凝血象、手术感染8项。

二、方法

1.

uc-mscs制备:按参考文献提供的方法[1],稍加改良后进行uc-mscs制备。简言之,经知情同意及感染源检定后收集脐带,去除外膜和动静脉,将脐带剪成0.5cm3大小的组织块,加入等体积0.2%i型胶原酶,37消化过夜。次日,加入两倍体积的0.05%的胰蛋白酶,37消化1小时。2000rpm离心10分钟收集细胞,计活细胞数。将细胞悬浮于人msc无血清培养基(杭州百威)中,按106细胞/cm2底面积接种于塑料培养瓶中。

1周后出现由数十个形态类似于成纤维细胞组成的集落。加入0.05%胰蛋白酶消化,并按6000细胞/cm2底面积进行传代培养。利用流式细胞术测定细胞表型,常规感染源检定后,收集细胞用于治疗。或收获细胞放于-80冰箱冻存备用,用前,在37环境下快速复苏,24~48小时培养,收获贴壁生长的细胞供临床应用。

2.

uc-mscs注射:入院第3或第4天开始给患者行腰穿,鞘内注射uc-mscs,1次/周,4次为1个疗程。按诊疗常规进行腰穿,将uc-mscs

10 ml(1x106/kg.次)+地塞米松5mg在10 min内缓慢注入蛛网膜下腔,拔针,敷以无菌辅料,嘱患者去枕平卧6

小时。

3.辅助治疗:系统康复锻炼。

4.评估标准[2]:(1)采用美国嵴髓损伤协会制定的嵴髓损伤神经功能评分标准(asia标准)对患者治疗前后神经功能进行评定:检查颈2到骶4~5神经支配的身体两侧各自28个皮节区痛觉和触觉,按消失、减退、正常分别给予o、l、2分,痛觉、触觉总分均为112分;检查颈5到骶1神经支配的身体两侧各自10个肌节中的关键肌,按肌力0~5级分别给予0~5分,总分为100分;(2)采用国际神经修复学会嵴髓损伤功能评价量表(ianr-scirfs)对患者治疗前后日常生活活动能力进行评定,包括上、下肢、躯干、全身运动功能、括约肌功能、肌张力、泌汗、皮肤营养、疼痛,最高分48分为正常。分值越低表示神经功能缺损越严重,日常生活活动能力越差;(3)损伤完全性评定:完全性损伤:损伤平面以下包括骶4~5既无感觉也无运动功能;不完全性损伤:损伤平面以下包括骶4~5有感觉(或)运动功能。

5.不良反应及并发症观察:观察治疗中及治疗后有无发热、腰痛、头痛、头晕等不良反应。

6.随访 对患者治疗后3个月、半年以及之后每半年随访1次,观察病情变化。

7. 统计学分析:采用spss 11.5软件包进行统计处理,计量资料以 sd表示,行数据配对t 检验、成组资料t

检验分析,p

结果

一、临床疗效:

1.22例患者中13例有效,总有效率为59.1%,9例无效。有5例有效的患者接受了2个或3个疗程治疗,疗效均有进一步的提高。有效患者多表现为运动和/或感觉功能改善,大小便控制能力增强。

2.

22例患者asia评分及ianr-scirfs评分显示:治疗后1个月与治疗前两组间比较痛觉、触觉、运动、日常生活活动能力评分有明显升高(p

3.16例不完全性sci患者中13例有效,有效率达81.25%,3例无效,治疗结束后1个月与治疗前两组间比较,痛觉、触觉、运动及日常生活活动能力评分有明显提高(p

4.sci部位存在软化灶的6例患者中5例治疗无效,无效的患者2例为不完全性sci,3例为完全性sci。

5.有效的13例患者损伤的时间2~204个月,平均59个月,无效的9例患者损伤时间4~136月,平均51个月,两组患者损伤时间无显着差异(p

> 0.05)。

6.不良反应及并发症:uc-mscs治疗中及治疗后,患者的生命体征均平稳。1例治疗后感头痛,1例治疗后感腰痛,未经特殊处理,1~3天后症状消失。无发热及其他不良反应。

7.随访

13例有效患者中9例治疗1月后疗效不再增加,3例治疗3月后疗效不再增加,1例治疗1年后疗效不再增加;9例无效患者病情无变化;所有患者无uc-mscs治疗相关的不良事件发生。

结果

一、临床疗效:

1.22例患者中13例有效,总有效率为59.1%,9例无效。有5例有效的患者接受了2个或3个疗程治疗,疗效均有进一步的提高。有效患者多表现为运动和/或感觉功能改善,大小便控制能力增强。

2.

22例患者asia评分及ianr-scirfs评分显示:治疗后1个月与治疗前两组间比较痛觉、触觉、运动、日常生活活动能力评分有明显升高(p

3.16例不完全性sci患者中13例有效,有效率达81.25%,3例无效,治疗结束后1个月与治疗前两组间比较,痛觉、触觉、运动及日常生活活动能力评分有明显提高(p

4.sci部位存在软化灶的6例患者中5例治疗无效,无效的患者2例为不完全性sci,3例为完全性sci。

5.有效的13例患者损伤的时间2~204个月,平均59个月,无效的9例患者损伤时间4~136月,平均51个月,两组患者损伤时间无显着差异(p

> 0.05)。

6.不良反应及并发症:uc-mscs治疗中及治疗后,患者的生命体征均平稳。1例治疗后感头痛,1例治疗后感腰痛,未经特殊处理,1~3天后症状消失。无发热及其他不良反应。

7.随访

13例有效患者中9例治疗1月后疗效不再增加,3例治疗3月后疗效不再增加,1例治疗1年后疗效不再增加;9例无效患者病情无变化;所有患者无uc-mscs治疗相关的不良事件发生。

讨论

sci是致残率最高的疾病之一,最常发生于青壮年,导致病人损伤平面以下感觉、运动功能丧失和/或大小便失禁,不仅给病人造成极大的痛苦,同时也给家庭和社会带来沉重的负担。嵴髓损伤可分为外伤性和非外伤性两种,前者占90%以上。本组患者除2例疾病引起外,20例为外伤所致,其中车祸、高空坠落为主要外伤原因,占75%。目前sci修复面临的主要问题是:原发和继发性神经元死亡,大量的轴突变性和弥漫性脱髓鞘;损伤后胶质瘢痕形成阻碍了轴突生长;局部炎症反应和神经营养因子、神经生长因子的缺乏,以及sci后损伤区微环境中大量的抑制因子的产生(如硫酸软骨素蛋白多糖、髓磷脂相关糖蛋白等),极大地阻碍了损伤神经的修复。手术、药物、物理康复等治疗都不能有效地解决这一世界级难题。间充质干细胞(mscs)具有来源广泛、取材容易、具有强大的增殖能力、在体外长期培养过程中始终保持其多向分化潜能,在适宜的条件下能分化为神经元及神经胶质细胞,还可分泌多种神经营养因子(ntfs)如神经生长因子(ngf)、脑源性神经营养因子(bdnf)、胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)[3,4],且在异基因移植中不存在免疫排斥反应[5],也不涉及医学伦理问题,为中枢神经系统损伤提供了新的治疗途径。

动物实验已证明mscs具有促进神经修复的作用。将大鼠mscs注入嵴髓损伤大鼠蛛网膜下腔,损伤部位的mscs明显高于未受损部位,一些mscs可分化为神经元和神经胶质细胞,促进嵴髓损伤的修复,且在体内无免疫排斥[6,7]。yang等[4]将人uc-mscs移植到完全性横惯性sci大鼠的损伤部位,大鼠的运动功能得到显着改善,病变周围皮质嵴髓束再生轴突和神经微丝的数目显着增加。目前mscs治疗sci所取得的研究成果多局限于动物模型,在临床上的应用仍处于起步阶段。pal等[8]将体外扩增的自体骨髓mscs(1x106个/kg体重)鞘内注射给30例sci患者,随访1~3年无不良事件发生。

ichim等[9]将异基因体外扩增的脐带血cd34+细胞及uc-mscs分别于损伤后5月、8月、14个月鞘内注射给1例腰髓损伤患者,该患者肌力、排便及性功能改善,神经疼痛减轻,无副作用发生。我们将体外扩增的uc-mscs鞘内注射给22例sci患者,总有效率为59.1%,有效患者增加疗程数疗效有一定提高;对不完全性sci患者有效率达81.25%;但对完全性sci患者无效;损伤部位如果存在软化灶的患者总体疗效欠佳,6例患者中仅1例有效。治疗过程安全,随访3月~3年无不良事件发生

mscs可来源于骨髓、脐带以及脐血。骨髓mscs含量低,104~105个骨髓单个核细胞含有1个msc,患者要经历采髓过程,还需要等待3周左右体外培养扩增;人脐血含有mscs,但传代培养困难,不易大量获得;人脐带华尔通胶含有丰富的mscs,在体外能够大量扩增,还可将其冻存,应用前复苏,短时间内即可收获足够量的细胞。shetty等[10]比较骨髓、脐带、脐血获得的mscs,这三种来源的mscs具有同样的mscs表面分子表达:cd73+、cd105+、ssea4+、cd29+、cd44+、hla

abc+,而脐带mscs(uc-mscs)与脐血mscs(ucb-mscs)不表达与移植排斥相关的hla

dr,在溷合淋巴细胞检测中呈免疫抑制,并抑制t细胞增殖,异体移植该细胞可产生免疫耐受性[5],表明其为一类免疫缺陷细胞,异基因移植不会发生免疫排斥反应。基于上述,我们选择人uc-mscs治疗sci。

鞘内注射的mscs进入嵴髓组织时要通过脑嵴液-脑屏障,

其通过的机制可能包括:(1)嵴髓损伤各种炎性因子和血管活性物质释放,使脑嵴液-脑屏障的通透性增加;(2)嵴髓损伤部位对mscs具有一定的趋化作用。关于uc-mscs治疗嵴髓损伤的作用机制尚不完全清楚,可能有:(1)uc-mscs向病变部位组织渗透融合,一些移植的mscs在新的环境下表达神经细胞表型,替代损伤细胞,重建神经通路,达到恢复神经功能的目的;(2)

uc-mscs分泌的各种ntfs,如ngf、bdnf、gdnf等,支持神经细胞生存,诱导内源性神经细胞再生,促进神经纤维在损伤部位再生

[11,12];(3)通过细胞间的接触、可溶性细胞因子分泌,抑制t淋巴细胞活性,调节炎性反应[13]。

mscs移植治疗sci的适宜时间,目前研究尚未统一。从病理机制上讲,sci后急性期由于血-嵴髓屏障破坏,损伤区有严重的免疫炎性反应,多种炎性因子具有神经毒性及胶质细胞的诱发作用,使局部的微环境不适合mscs的存活和分化。而sci时间过长,损伤区胶质瘢痕的形成不利于轴突的生长。okano等[14]提出sci后干细胞移植的最佳时间应选择在损伤后l~2周,在此期间进行移植,既可解除急性期各种炎性因子对移植细胞的损害,又可避免慢性期胶质瘢痕对轴突再生的干扰。本组患者均在慢性期行mscs治疗,有效患者与无效患者在损伤时间上无明显差异。

本研究表明,uc-mscs蛛网膜下腔注射治疗sci是安全的,可使大部分不完全性sci患者神经功能在一定程度上得到恢复,但对完全性sci患者无效,存在软化灶的患者多数疗效较差。uc-mscs治疗sci的作用机制有待进一步研究,移植时机的选择、取得显着疗效所需的mscs的数量、疗程数,以及最佳的治疗途径,需要大宗病例长期的随机对照研究。

间充质干细胞治疗:

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